Tytuł operacji:

"Opracowanie metody identyfikacji odmian pszenicy ozimej uprawianych w Polsce"

Cel operacji:

"Celem operacji jest opracowanie technologii identyfikowania odmian pszenicy ozimej z wykorzystaniem najnowszych metod pozyskiwania markerów molekularnych. W wyniku badań ustalone zostaną profile markerowe pozwalające na odróżnianie odmian od siebie nawzajem".

Skrócony opis operacji:

Wysoka wartość użytkowa pszenicy zwyczajnej sprawia, że każdego roku do Krajowego Rejestru (KR) trafia od kilku do kilkunastu nowych odmian.
 Zgłaszane do rejestracji rody hodowlane muszą spełniać zarówno wymagania co do odrębności, wyrównania i trwałości ale i również posiadać odpowiednio wysoką wartość gospodarczą konieczną by skutecznie konkurować na rynku. Wraz ze wzrostem liczby odmian i stale zawężającą się pulą genową wykorzystywaną w tworzeniu odmian coraz trudniej jest skutecznie porównywać nowo zgłoszoną odmianę z innymi dostępnymi odmianami.
Charakterystyka rejestrowa nowych odmian polega najczęściej na precyzyjnym opisie jej cech morfologicznych, fizjologicznych zarówno na poziomie jakościowym jak i ilościowym. Istotnym elementem usprawniającym proces analizy odrębności nowej odmiany byłoby stwierdzenie zróżnicowania na poziomie genetycznym.
Takie charakterystyki wprowadzają zagraniczne firmy hodowlane, dzięki czemu mają pewność, że ich nowa odmiana jest na pewno odrębna od innych.
Rolnik czy producent rolny, kupujący kwalifikowany materiał siewny od przedsiębiorstwa specjalizującego się w nasiennictwie chciałby mieć pewność, że jest to dokładnie ta odmiana, którą wybrał. Szczególnie jeśli wybrana odmiana posiada specyficzne właściwości np. jakościowe, które są wymagane przez przedsiębiorstwa przetwórstwa rolnego. Uprawa innej, nieodpowiedniej, odmiany mogłaby spowodować nieosiągnięcie zakładanych parametrów jakościowych, a co za tym idzie wymierne straty finansowe. Rozwiązaniem opisanych wyżej problemów będzie opracowanie technologii tworzenia profili DNA odmian, która umożliwi ich identyfikację i rozróżnianie na bazie stabilnych markerów molekularnych.

Skład grupy operacyjnej:

  1. Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, jednostka naukowa, Lider.
  2. Danko Hodowla Roślin Sp. z o.o., przedsiębiorca.
  3. Zachodniopomorski Ośrodek Doradztwa Rolniczego w Barzkowicach, podmiot doradczy.

Budżet operacji:

Budżet całkowity operacji: 1 251 407,00 zł

Kwota pomocy: 1 119 252,00 zł

1)    ze środków EFRROW w wysokości 712 180, 04 zł, co stanowi 63,63 % przyznanej pomocy na realizację operacji,

2)    z krajowych środków publicznych, w wysokości 407 071,96 zł, co stanowi 36,37 % przyznanej pomocy na realizację operacji.

 

Informacja o osiągniętych wynikach przeprowadzonych prac badawczych

 

Etap I

Zebrano materiał roślinny, w tym 124 odmiany pszenicy ozimej podchodzące głównie od partnera konsorcjum firmy hodowlanej DANKO Sp. z o.o., oraz krajowych i zagranicznych przedsiębiorstw hodowlanych i nasiennych. Z tej puli wybrano 8 odmian pochodzących z różnych firm, które stanowiły wzorce badawcze. Nasiona skiełkowano i doprowadzono do stadium siewki po czym ścięto liście.

 

Przygotowanie siewek

Fot. 1. Przygotowanie siewek pszenicy do izolacji DNA.

 

Do pojedynczej próby zebrano średnio 8 fragmentów liści o zbliżonej wadze. Każdą odmianę badano w 3 powtórzeniach. Do izolacji DNA genomowego wykorzystano zakupiony na te potrzeby zestaw DNeasy Plant Mini kit firmy Qiagen zgodnie z protokołem załączonym przez producenta. Wyizolowane DNA sprawdzono pod kątem koncentracji i czystości. Kilka prób powtórzono. W kolejnym kroku przygotowano dwie biblioteki. Jedną opartą o protokół z Uniwersytetu Cornella (USA) oraz drugą z wykorzystaniem zestawu Nextera XT DNA Library kit. Zgodnie z protokołami, częściowo zmodyfikowanymi przez nasz zespół, strawiono i pofragmentowano DNA badanych odmian.

 

 

Fot. 2. Przygotowania próbek do sekwencjonowania bibliotek DNA.

 

Po określeniu koncentracji, normalizacji i denaturacji biblioteki zsekwencjonowano.

 

Fot. 3. Wykres przebiegu i parametrów jakościowych sekwencjonowania.

 

Dane z sekwencjonowania poddano analizie bioinformatycznej przy użyciu programów własnych: Geneious 11, CLC Genomic Workbench, oraz zakupionym na te potrzeby do projektu programie NextGene 2.4. Uzyskane liczby fragmentów DNA poskładane w kontigi zamieszczono w tabeli 1.

 

Tabela 1. Charakterystyka sekwencyjna badanych odmian wzorcowych.

Powtórzenie (liczba czytań 100-300 nt)

SPENCER

VENECJA

IMPRESJA

BELISSA

MUSZELKA

BŁYSKAWICA

DAKOTANA

SYMETRIA

I

245 438

272 764

369 498

292 592

224 860

281 246

65 580

205 150

II

233 218

294 430

267 102

283 288

134 704

283 970

187 276

254 250

III

420 012

251 016

322 054

317 076

225 154

418 870

261 019

256 782

Suma I+II+III

898 668

818 210

958 654

892 956

584 718

984 086

513 875

716 182

Liczba kontigów

49 346

43 258

44 526

49 482

30 215

42 558

37 172

38 195

Min. długość kontigu

300

300

300

300

300

300

300

300

Max. długość kontigu

3 363

4 224

3 321

3 808

2 362

3 055

2 904

4 260

Średnia długość kontigu

491

482

487

491

459

475

463

470

N75

378

375

378

380

363

370

364

367

Liczba kontigów

49 346

43 258

44 526

49 482

30 215

42 558

37 172

38 195

Min. liczba kontigów na chromosomie

1 645

1 232

1 477

1 420

1 001

1 260

1 103

1 269

Max. liczba kontigów na chromosomie

2 720

2 379

2 479

2 762

1 660

2 295

2 051

2 117

Średnia liczba kontigów/ chromosom

2 147

1 883

1 942

2 147

1 321

1 842

1 650

1 666

 

Etap II

W ramach etapu II w pierwszej kolejności dokonano powtórek i uzupełnień danych bibliotek. Następnie wygenerowane dane sekwencyjne przyrównano do międzynarodowej sekwencji referencyjnej pszenicy (IWGSC CS RefSeq) i wytypowano te odcinki DNA, które wykazywały się zmiennością – wykrywały mutacje typu SNP i INDEL między odmianami a Referencją. Wstępnie wytypowano 1500 fragmentów DNA do których zaprojektowano startery, krótkie (około 20 nukleotydów) odcinki DNA służące do powielania fragmentów matrycy DNA w tysiącach kopii.

 

 

Fot. 4. Projektowanie starterów do wytypowanego odcinka referencyjnego DNA.

 

Wszystkie fragmenty badane dla 8 odmian następnie rozdzielono, zarówno w klasycznych żelach agarozowych na początku, a w następnej kolejności z zastosowaniem urządzenia Qiaxel. Wybrano najlepsze markery, które składano w pakiety (multiplex) by zaoszczędzić liczbę wykonywanych amplifikacji (bez tego etapu każda odmiana wymagała by 5-6 płytek 96 dołkowych). Do tego celu zastosowano specjalistyczny program. Po konstrukcji multiplexów testowano ich efektywność oraz zmieniano dobór niektórych kombinacji plex.

 

 

Fot. 5 Rozdział fragmentów DNA w żelach agarozowych.

 

Fot. 6. Rozdział fragmentów DNA przy użyciu elektroforezy kapilarnej.

 

W trakcie etapu drugiego uzyskano materiał liściowy z rodów hodowlanych firmy DANKO Sp. z o.o., z którego wyizolowano DNA, oczyszczono, zmierzono koncentrację i rozcieńczono na potrzeby reakcji PCR. Jednocześnie partner konsorcyjny na swoich poletkach eksperymentalnych założył doświadczenie z udziałem wspomnianych wyżej rodów badawczych. Doświadczenie obejmowało 96 rodów wysianych w dwóch powtórzeniach. Na roślinach rosnących na tych poletkach przeprowadzono szereg pomiarów w tym: oceniono plon nasion, wysokość roślin, termin kłoszenia, odporność na choroby grzybowe i porastanie.

 

 

Fot. 7. Widok poletek doświadczalnych z rodami pszenicy na polach firmy DANKO Sp. z o.o.

            (Zdjęcie własne DANKO Sp. z o.o.)

 

Etap III

 

Rozpoczęto testowanie, początkowo 500, a po korekcie finalnie 470 markerów w multiplexach na 8 odmianach wzorcowych w 3 powtórzeniach. Przeprojektowano startery potrzebne do tych analiz dodając końce indeksowane zgodne z technologią sekwencjonowania. Pierwsze testy otrzymanych fragmentów DNA przeprowadzano dodatkowo kontrolując czy uzyskiwane są produkty PCR. Produkty amplifikacji zbierano w pule po czym oczyszczano przygotowując w ten sposób biblioteki sekwencyjne. Do tego celu wykorzystano zmodyfikowany protokół 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation. Następnie pule multiplexów sekwencjonowano. Uzyskane wyniki sekwencyjne były zróżnicowane w zależności od odmiany i wahały się od 168 022 sekwencji (46mln nt.) do 1 058 358 sekwencji (280 mln nt.). Kolejnym krokiem było porównanie czytań sekwencyjnych z sekwencją referencyjną. W pierwszym etapie porównywano sekwencje dla odmian z  IWGSC CS RefSeq. Ponieważ liczba wykrywanych SNP była zbyt duża i nie w pełni wiarygodna wybrano inną drogę. Wygenerowano sekwencje rozpoczynające się i kończące sekwencjami starterów. W ten sposób wytworzono pule 470 sekwencji referencyjnych, do których finalnie porównywano uzyskane czytania dla odmian. Kontrolnie sprawdzano również te same wyniki w porównaniu do międzynarodowej referencji. Pozwoliło to wygenerować 2067 mutacji typu SNP/INDEL.

 

Fot. 8. Przykład identyfikacji mutacji SNP w markerze  Po7A11_FR w porównaniu do sekwencji referencyjnej.

 

Etap IV

W ramach etapu IV utworzono biblioteki dla 116 odmian pszenicy oraz 96 rodów hodowlanych w 3 powtórzeniach. Biblioteki oczyszczono, znormalizowano i wykonano sekwencjonowanie zgodnie z przyjętym wcześniej protokołem. Uzyskane wyniki, po dodaniu do nich wcześniej badanych 8 odmian, pozwoliły na utworzenie matrycy rozróżniającej testowane odmiany. Spełniono zatem cel główny operacji.

 

 

Fot. 9. Fragment macierzy SNP/INDEL rozróżniająca pulę badanych odmian

 

Zestawione dane pozwoliły na określenie podobieństwa genetycznego pomiędzy odmianami, które zwizualizowano w postaci drzewa filogenetycznego. Wykazano, że opracowana metoda rozróżnia wszystkie badane odmiany, a „nadmiar” markerów pozwala porównywać nawet do kilkuset obiektów jednocześnie. Dodatkowo stwierdzono, że maksymalne podobieństwo genetyczne badanych obiektów nie przekracza 0,35 a minimalne 0,11. Potwierdza to potencjał metody do badania i porównywania setek obiektów.

 

  

Fot. 10. Drzewo podobieństwa filogenetycznego badanych odmian.

 

W celu weryfikacji i wdrożenia opracowanej technologii przebadano 96 rodów pszenicy ozimej należących do firmy hodowlanej DANKO Sp. z o.o.
Materiały te są na wczesnym etapie hodowli.

W ramach testu wygenerowano identyczny zestaw markerów jak dla odmian, który wykorzystano do oszacowania podobieństwa genetycznego rodów.

 

Fot. 11. Fragment macierzy SNP/INDEL rozróżniająca pulę badanych rodów.

 

W kolejnym kroku wygenerowano, podobnie jak dla odmian, drzewo filogenetyczne pozwalające oszacować zróżnicowanie genetyczne wyprowadzanych rodów.

 

Fot. 12. Drzewo podobieństwa genetycznego badanych rodów.

 

Dodatkowo wykonano analizę mapowania asocjacyjnego wykorzystując dane sekwencyjne dla badanych rodów pszenicy i wyniki pomiarów cech ilościowych. Wygenerowano w ten sposób matrycę dodatkowych danych wskazujących na markery potencjalnie związane z plonem i innymi ocenianymi cechami.

 

Wyniki badań zaprezentowano na międzynarodowej konferencji naukowej: „Genetyka ilościowa i hodowla roślin uprawnych”, która odbyła się
w Karpaczu w dniach 28.02 – 03.03 2023 roku. Na konferencji tej wygłoszono referat pt.: „Opracowanie modyfikacji metody genotypowania pszenicy ozimej”, z którego streszczenie opublikowano w materiałach konferencyjnych.

 

 

Fot. 13. Wyniki prac badawczych prezentowane na sympozjum oraz zdjęcie zespołu badawczego promującego operację na targach rolniczych
„Agro Pomerania” w Barzkowicach.